1、分離純化
將每個(gè)15mL離心管內(nèi)溶液混勻，然后用巴斯德玻璃吸管從溶液底部緩慢加入5mlPercoll-蔗糖溶液，加入過程中避免攪混兩種溶液。在1050g、20℃條件下離心10min(勿用制動(dòng)器，減速度為0)。離心結(jié)束后，用塑料吸管取中間層(從中間層上部吸取)富含孢囊的混合液于新的15ml離心管中。同一個(gè)樣品的孢囊混合液可放置于同一離心管中。向離心后的沉淀物中添加2.5mL的PBST，混勻。再次從溶液底部緩慢加入5mlPereoll-蔗糖溶液按照上述步驟進(jìn)行二次分離純化，純化后取中間層混合液，與上述混合液合并。
2、染色
用免疫組化筆在醋酸纖維濾膜的外周畫圓圈，再用鑷子將濾膜平移至純水液面上使其反面濕潤(rùn)。操作時(shí)濾膜不要浸入液面。
將上述醋酸纖維濾膜用平頭鑷子平移至真空抽濾器上，用吸管吸取上述混合液逐滴加到圓圈內(nèi)進(jìn)行抽濾。滴加時(shí)避免將混合液濺到圓圈外。抽濾過程中，濾膜上要保持有一薄層液面，以防止濾膜干燥后破損。抽濾液體后，用3mlPBS淋洗15ml離心管，淋洗液用上述方法抽濾。抽濾液體后，在濾膜圓圈內(nèi)滴加0.50mLBSA溶液，保持2min，若圓圈內(nèi)仍有明顯液體殘留則繼續(xù)抽濾。
用鑷子將濾膜平移至載玻片上，在濾膜圓圈內(nèi)滴加一滴免疫熒光試劑。將載玻片置于潮濕暗環(huán)境中，在室溫條件下避光靜置30min。再向?yàn)V膜圓圈內(nèi)滴加0.10mLDAPI染色溶液，室溫條件下避光靜置10 min。
用鑷子將濾膜平移至真空抽濾器上進(jìn)行抽濾，在濾膜圓圈內(nèi)滴加4mLPBS進(jìn)行淋洗。抽濾液體后，依次向圓圈內(nèi)滴加各3ml的脫水劑30、脫水劑70和脫水劑90進(jìn)行抽濾。
于新的載玻片上滴加1滴DABCO-甘油，用鑷子將上述濾膜平行移到有DABCO-甘油的載玻片上。再在濾膜圓圈內(nèi)滴加一滴DABCO-甘油，蓋上蓋玻片(不要有氣泡)并進(jìn)行固定。于0℃~4℃冷藏避光保存，保存期為7d。
3、鏡檢
使用泰林基于人工智能技術(shù)的兩蟲自動(dòng)識(shí)別系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)人工智能圖像處理自動(dòng)識(shí)別代替人工肉眼識(shí)別；建立賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊形態(tài)圖像數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別算法和多維度判識(shí)；全自動(dòng)玻片兩蟲區(qū)域識(shí)別對(duì)焦觀察，解放人工觀察雙手雙眼，可自動(dòng)完成區(qū)域掃描、觀察、成像；徹底解決傳統(tǒng)分析方法的費(fèi)時(shí)、效率低、依賴經(jīng)驗(yàn)等難題，降低兩蟲識(shí)別門檻，提高檢測(cè)效率。
