產(chǎn)品貨號(hào)：ZC-RTPCR-460
產(chǎn)品名稱：肺炎支原體核酸檢測(cè)及分型試劑盒（熒光PCR法）
包裝規(guī)格：25T/盒、50T/盒
預(yù)期用途：本試劑盒可用于口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液及細(xì)胞培養(yǎng)物中肺炎支原體檢測(cè)以及1型、2型的基因分型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅供科學(xué)研究使用，不作為臨床診斷依據(jù)。
儲(chǔ)存條件及有效期：
（1）運(yùn)輸：試劑盒必須在4℃條件下運(yùn)輸。
（2）保存：-20℃±5℃保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。
（3）有效期：12個(gè)月，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用。
檢驗(yàn)方法：
（1）樣品制備（樣本處理區(qū)） 細(xì)菌培養(yǎng)物樣本：取1mL 增菌菌液或 1mL菌懸液（生理鹽水或 1×TE）加入到 1.5mL 無(wú)菌離心管中，8000 rpm 離心 5 min后棄上清，保留沉淀，加入 DNA 提取液50μL，將沉淀懸浮后 100℃加熱處理5min，12000 rpm 離心 2 min，取上清 進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。 口咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液等樣本：建議使用商品化的 DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑 盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
注：提取好的DNA應(yīng)及時(shí)用于檢測(cè)，否則應(yīng) - 20±5℃保存。
（2）反應(yīng)體系配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)） 從試劑盒中取出試劑進(jìn)行室溫解凍，顛倒混勻后瞬時(shí)離心。每個(gè)樣品均應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若待檢樣品數(shù)量為n，則按 （n+1）個(gè)反應(yīng)配制體系，建議增加陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照體系。將檢測(cè)液按照每管20μL分裝于PCR儀適用的PCR管中，蓋 緊管蓋并做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)進(jìn)行加樣操作。
（3）加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟1提取的DNA、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
（4）熒光PCR循環(huán)條件設(shè)置（核酸擴(kuò)增區(qū)）
| 程序 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 反應(yīng)時(shí)間 | |
| 1 | 1 | 94℃ | 30sec | |
| 2 | 40 | 94℃ | 5sec | |
| 58℃ | 30sec | 采集熒光 | ||
檢測(cè)設(shè)置：反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；“Reporter Dye”設(shè)置為FAM（普通TaqMAN探針）、VIC（MGB探針）， “Quencher Dye”均為MGB。
（5）結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定 設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線 至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn) 陰性對(duì)照：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú)Ct值顯示； 陽(yáng)性對(duì)照：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且Ct值<35； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
5.3 結(jié)果判斷 陽(yáng)性：檢測(cè)通道Ct值<35.0，且有明顯的擴(kuò)增曲線。 可疑：檢測(cè)通道35.0≤Ct值<40.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<40.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性：檢測(cè)通道無(wú)Ct值或無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。
檢驗(yàn)結(jié)果：
| 熒光通道 | FAM | VIC |
| 鑒定菌種 | 肺炎支原體1型 | 肺炎支原體2型 |